动物新型疫苗研究进展

近20年来，随着生物技术在兽用生物制品领域应用的不断深入和发展，疫苗制造技术和免疫学技术得到迅速发展，产生了多种新型疫苗，包括基因重组亚单位疫苗、活疫苗等。载体基因工程疫苗、基因工程缺失疫苗和植物基因工程疫苗等。此外，除了疫苗在动物疾病预防方面的应用外，新技术还延伸到治疗性疫苗、肿瘤疫苗和生理调节疫苗等领域。核酸疫苗、T细胞疫苗和树突状细胞疫苗的出现，彻底改变了疫苗多为蛋白质，只能预防的经典观念，极大地拓展了人们对疫苗成分和功能的认识。它们被称为疫苗学的第三次革命。虽然目前国际上已经注册并正式投放市场的新型疫苗并不多，但它们代表了一种新的疫苗研究方式，为克服一些常规疫苗的缺陷带来了希望，因此受到越来越多的关注. 1、重组亚单位疫苗基因工程重组亚单位疫苗是利用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核或真核细胞，使其在受体细胞中高效表达并分泌保护性抗原蛋白。提取保护性抗原蛋白，加入合适的佐剂制成基因工程重组亚单位疫苗。应用重组DNA技术开发重组亚单位疫苗，必须有合适的表达系统来生产目的基因产物。用于生产此类疫苗的表达系统主要包括原核生物、真菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞。其中，最常用的原核生物是大肠杆菌（E.coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。这类疫苗的研制步骤是：（1）通过DNA重组技术，将编码所需多肽（保护性抗原）的基因插入表达载体（质粒）中； (2)将插入外源基因的重组表达质粒导入系统细胞宿主； (3)鉴定和选择表达目的多肽的细胞，进行纯培养繁殖； (4)优化表达系统中基因表达和产物稳定性的调控参数，实现目的基因产物的高水平表达。兽用口蹄疫基因工程亚单位疫苗、大肠杆菌菌毛基因工程重组亚单位疫苗预防仔猪和犊牛腹泻发挥了一定作用必需的免疫原性成分，不含传染性物质，安全性好。接种后不会发生急性、持续性或潜伏性感染，可用于某些不适合活疫苗的情况，如妊娠动物。将高度危险和致病性病原体的免疫原性蛋白质编码基因转移到非致病性和无害微生物中进行大规模生产，增加了安全性。 (2)常规活疫苗或灭活疫苗不可避免的热原、过敏原、免疫抑制剂等有害反应物在疫苗中减少或消除，副作用小。 (3)稳定性好，便于储存和运输。 (4)可用于外来病原体和不能培养的病原体，扩大了疫苗控制流行病的范围。 (5) 产生的免疫反应可与感染产生的免疫反应区分开来，更适用于疫情的控制和消灭计划。其缺点是：（1）价格昂贵。虽然产品生产本身的成本不一定高，但产品研发的成本通常更高。 (2) 免疫原性通常比复制完整的病原体差，需要多次免疫才能有效保护。目前，人类乙型肝炎基因工程亚单位疫苗已得到广泛应用。用于动物的口蹄疫基因工程亚单位疫苗、预防仔猪和犊牛腹泻的基因工程大肠杆菌菌毛亚单位疫苗发挥了一定作用。炭疽保护性抗原（PA）、致死因子（LF）和水肿因子（EF）三联毒素亚单位疫苗、羊蹄腐病菌毛拟杆菌亚单位疫苗、链球菌和牛布鲁氏菌亚单位疫苗、疱疹病毒主要糖蛋白亚单位疫苗和生长抑素（14肽）亚单位疫苗已取得良好进展。 2、重组活载体疫苗基因工程重组活载体疫苗是利用基因工程技术，将病毒或细菌（一般为疫苗减毒株）构建成载体（或外源基因载体），将外源基因（包括重组多肽）、肽链抗原性位点等）插入活疫苗中进行表达。 接种该类疫苗的动物向宿主免疫系统递交免疫原性蛋白的方式与自然感染时的真实情况非常接近，可诱发广泛的免疫，包括体液免疫、细胞免疫，甚至粘膜免疫，因此可以避免重组亚型。单位疫苗有很多缺点。如果同时将多个外源基因插入到载体中，就可以达到一针预防多种疾病的目的。简而言之，活病毒载体疫苗结合了常规活疫苗和灭活疫苗的优点。具有活疫苗免疫效力高、成本低、灭活疫苗安全性好等优点。是当前和未来疫苗研发的主要方向之一。国外已研制出以腺病毒为载体的乙型肝炎疫苗和以疱疹病毒为载体的新城疫疫苗。当然，由于身体对活载体的免疫反应的性质，此类疫苗有时会限制重新免疫的效果。目前主要的活病毒载体有牛痘病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、人2型和5型腺病毒、火鸡疱疹病毒、伪狂犬病病毒、水痘带状疱疹病毒、microRNA病毒、黄病毒和脊髓灰质炎病毒等，主要细菌活载体包括卡介苗、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、大肠杆菌、乳杆菌、志贺氏菌。 (1)重组载体病毒和活疫苗病毒载体有两种：一种是复制缺陷型载体病毒，只有通过特定转化细胞的互补或辅助病毒的叠加感染才能产生感染性后代，因此不存在解毒隐患，同时还能表达靶抗原，产生有效的免疫保护作用。例如，以金丝雀痘病毒为载体，表达新城疫病毒的HF基因，用于预防鸡新城疫。另一种是具有复制能力的病毒，如疱疹病毒、腺病毒、痘病毒等，可以作为外来基因的载体，保持其传染性。该载体病毒成功表达了多种重组蛋白，攻击和保护效率良好。 1、痘病毒载体：痘病毒是研究最早、最成功的载体病毒之一。宿主范围广、增殖效价高、稳定性好。大基因容量和许多非必需区域的基因。因此，有利于进行基因工程操作，易于构建和分离重组病毒。它还可以插入多个外源基因，并且对于插入的外源基因具有更高的表达水平。目前，该载体病毒已成功表达多种重组蛋白，攻击和保护效率良好。例如，HIV-1主要包膜蛋白（gp120）的重组痘病毒已进入临床试验；使用禽痘病毒载体已成功表达流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒、禽网状内皮增生病毒、狂犬病病毒、传染性支气管炎病毒毒、麻疹病毒、猿猴免疫缺陷病毒、艾美尔球虫等的保护性抗原基因，其中部分产品已正式注册。 　　有许多病毒的抗原基因用腺病毒载体表达成功，如伪狂犬病病毒gP50蛋白、狂犬病病毒G蛋白、HIV env/gag和gp160蛋白、轮状病毒VP4和VP7蛋白及鸡IBDV VP2蛋白等 　　2、腺病毒载体：腺病毒作为活载体也是目前研究热点之一。虽然腺病毒载体对外源基因的容量较小(20kb)，但它具有独特的优点：(1)腺病毒比较安全。(2)腺病毒的靶细胞范围广，不仅能感染复制分裂细胞，而且能感染非复制分裂细胞。(3)腺病毒容易制备，对热不敏感，在适合的培养系统中呈高滴度增殖。(4)腺病毒可以在肠道及呼吸道繁殖，能诱导黏膜免疫，能制成药囊经口服途径接种以预防消化道及呼吸道感染。(5)Ad2、Ad5等启动子较强，能高水平表达外源基因，特别是换以更强的启动子如CMV早期启动子后，更可明显提高外源基因的表达水平。目前已有许多病毒的抗原基因用腺病毒载体表达成功，如伪狂犬病病毒gP50蛋白、狂犬病病毒G蛋白、HIV env/gag和gp160蛋白、轮状病毒VP4和VP7蛋白及鸡IBDV VP2蛋白等。 　　活载体表达外源基因作为疫苗的研究主要有：单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒等 　　3、疱疹病毒载体：随着疱疹病毒弱毒苗的问世及质量不断提高，以此为基础的活载体也逐渐成为研究目标。疱疹病毒的基因组较大，约150kb左右，可容纳多个外源基因的插入。大多数疱疹病毒(伪狂犬病毒除外)的宿主范围很窄，其重组病毒的使用不会产生流行病学方面的不良后果。许多疱疹病毒经粘膜途径感染，构建的载体活疫苗可经黏膜途径提呈抗原，诱导特异性黏膜免疫。目前，疱疹病毒作为活载体表达外源基因作为疫苗的研究主要有：单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒、牛疱疹病毒I型、马疱疹病毒I型和传染性喉气管炎病毒等。其中，火鸡疱疹病毒活载体，是禽病毒基因工程研究中比较活跃的领域。新城疫病毒的F和HN基因重组马立克氏病毒疫苗、马立克氏病HVT/MDVgB重组疫苗、传染性法氏囊病病毒VP2基因重组HVT活载体疫苗取得很好研究进展。利用口蹄疫病毒、猪瘟病毒重组伪狂犬病病毒活载体疫苗、表达FMDV VP1基因及PRV的gⅢ基因的重组牛Ⅰ型疱疹病毒活载体疫苗研究也取得明显进展。 　　但是，用上述痘病毒、疱疹病毒和腺病毒作载体也带来一些问题，这些病毒对体内复制的复杂要求，毒力性质还不完美，宿主范围不如人意，都需进一步研究。例如腺病毒在淋巴组织和疱疹病毒在神经组织的持续感染，疫苗病毒感染的进行性过程等都是必须认真对待的问题。我们必须更好地了解这些载体病毒发生具体缺失突变的后果，如在插入外源基因时所引起的突变，它们可能影响毒力，亲嗜性宿主范围以及免疫原性。  　　4、小RNA病毒载体：近年来以RNA病毒为活载体的研究令人鼓舞，如已证明脊髓灰质炎病毒疫苗株在实际应用中安全，可口服。病毒容易增殖，感染滴度高。该载体表达的外源蛋白以嵌合形式存在于载体病毒颗粒表面，故免疫效果较理想，如HIVgP41重组脊髓灰质炎病毒可诱导兔产生中和抗体。 　　(二)重组载体细菌活疫苗　以疫苗株沙门氏菌、李斯特氏菌和卡介苗作为外源基因的载体已越来越引起研究者们的兴趣，并具有巨大的应用潜力，它除了具有病毒活载体的优点外，还具有培养方便，外源基因容纳量大，刺激细胞免疫力强等优点。细菌载体本身就起佐剂作用，刺激产生强的B细胞和T细胞免疫应答。口服沙门氏菌疫苗还能刺激黏膜免疫，且不像其他疫苗需要注射，因此用它作载体更具有吸引力。把外源基因插入合适的载体质粒，转化进细菌，或导入细菌染色体。以细菌为载体的疫苗比重组载体病毒活疫苗的研究难度更大，但近年来在构建多价疫苗方面已取得相当大的进展，如把志贺氏菌、霍乱弧菌和大肠埃希氏菌的抗原基因导入沙门氏菌表达，猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白重组结核分支杆菌疫苗等。 　　三、基因缺失疫苗 　　基因缺失疫苗是用基因工程技术将病毒致病性基因进行缺失，从而获得弱毒株活疫苗。用基因突变、缺失和插入的方法使病原体致弱，研制新的基因工程苗统称为重组疫苗。在微生物基因组插入或添加基因的方法制成的疫苗又称为基因添加疫苗。由于这些基因的变化，一般不是点突变(经典技术培育的弱毒株常是基因点突变)，故其毒力更为稳定，返突变机率更小，疫苗安全性好、不易返祖；其免疫接种与强毒感染相似，机体可对病毒的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚实，免疫期长，尤其是适于局部接种，诱导产生黏膜免疫力，因而是较理想的疫苗。目前已有多种基因缺失疫苗问世，例如：(1)伪狂犬病毒基因缺失疫苗：该苗是通过研制伪狂犬病毒TK－缺失突变体使病毒致弱而获得，是1986年1月得到美国FDA批准从实验室到市场的第一个基因工程苗。在注册之前即已证明该疫苗无论是在环境中还是对动物都比野生型病毒和常规疫苗弱毒更安全。后来的伪狂犬病基因缺失苗所使用的缺失突变体，同时缺失TK基因和gpE、gpC和gpG三种糖蛋白基因中的一种。这种新一代的基因缺失苗产生的免疫应答很容易与自然感染的抗体反应区别开来，又称为“标记”疫苗，它有利于疫病的控制和消灭计划。(2)霍乱弧基因缺失疫苗：将霍乱弧苗A亚基基因中94％的A1基因切除，保留了A2和全部B基因，再与野生菌株同源重组筛选出基因缺失变异株，而获得无毒的活菌苗。(3)大肠杆菌基因缺失疫苗：将大肠杆菌LT基因的A亚基基因切除，将B亚基基因克隆到带有粘着菌毛(K88，K99，987P等)大肠杆菌中，制成不产生肠毒素的活菌苗。 　　四、多肽疫苗 　　多肽疫苗是用化学合成法或基因工程手段合成病原微生物的保护性多肽或表位并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。随着抗原表位作图技术研究进展，将抗原表位精确定位于某几个氨基酸残基成为可能。因此，如果某些线性中和抗原在完整蛋白中呈弱免疫原性，不利于制备疫苗时，则可通过基因工程技术，将这些线性抗原表位进行体外表达，使其抗原结构充分暴露，便可增强其免疫原性。当然，这些抗原表位单独存在时，其免疫原性常常较低，需通过下列3个途径加以改进：(1)与其他颗粒抗原(如HBsAg)进行融合蛋白表达；(2)将其与无毒力的结核菌素或霍乱毒素等细菌蛋白连接；(3)自身串联表达，形成复合肽。多肽疫苗的优点是可在同一载体上连接多种保护性肽链或多个血清型的保护性抗原肽链，这样只要一次免疫就可预防几种传染病。目前研制成功的多肽疫苗还不多，除口蹄疫合成肽疫苗外，还有乙型肝炎和疟疾合成肽疫苗的报道。该类疫苗的缺点是制造成本较高。 　　五、基因疫苗 　　基因疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前，研究较多的是DNA疫苗。它由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。其被导入机体的方式主要是直接肌肉注射，或用基因枪将带有基因的金粒子注入。由于它不需任何化学载体，故又称裸DNA疫苗。但现在已有研究报道采用细菌载体等运送基因疫苗，即口服DNA疫苗，以期在黏膜局部免疫方面一展身手。 　　核酸疫苗于1989年由美国Wolff及Vical偶然发现，1992年Ulmer等将含流感病毒核心蛋白(NP)基因序列的重组质粒注射小鼠股四头肌，发现的确刺激产生了特异性的CTL，能保护小鼠抵抗不同流感病毒株感染，从而赋予疫苗全新的含义：(1)基因疫苗刺激机体产生免疫应答的过程类似于病原微生物感染或减毒活疫苗接种，其诱导产生的CTL反应可以抵抗和清除病原体感染。(2)以往对外膜蛋白容易变异的流感病毒、丙肝病毒(HCV)及免疫缺陷病毒(HIV)等缺乏有效疫苗，现在看来，它们的核心蛋白均非常保守，刺激机体产生的细胞免疫不仅可能预防不同病毒株的交叉感染，而且可能在治疗某些持续感染性疾病中有其积极的意义，所以基因疫苗克服了减毒活疫苗的可能返祖并导致人类和动物疾病及病毒发生变异而对新型的变异株不起作用的缺点。(3)基因疫苗诱导的CTL细胞免疫也可能用于抗肿瘤免疫。因此，DNA免疫的发现被视为疫苗业的一场革命，开辟了疫苗研究的新时代。 　　核酸疫苗除上述优点外，还具有以下明显优点：(1)外源基因在体内存在较长时间，不断表达外源蛋白，持续给免疫系统提供刺激，因此能够刺激产生较强和较持久的免疫应答。(2)核酸疫苗具有共同的理化特性，因此可以将含有不同抗原基因的质粒混合起来进行联合免疫。(3)质粒载体没有免疫原性，因此可以反复使用。 　　DNA免疫已经成为世界瞩目的防治传染病、肿瘤以及移植免疫治疗的新的研究热点，并取得很好研究进展 　　目前，DNA免疫已经成为世界瞩目的防治传染病、肿瘤以及移植免疫治疗的新的研究热点，并取得很好研究进展。国外已有多家公司，开通了介绍核酸疫苗的网站，如WWW．DNAvaccine.com。有关核酸疫苗论文每年数以千计，与核酸疫苗相关的专利已超过120项。足以看出核酸疫苗的广泛的应用前景。迄今，国外已有至少4种核酸疫苗被批准进入Ⅰ期临床试验，包括美国、瑞士和英国的艾滋病核酸疫苗、美国的成纤维细胞生长因子DAN疫苗。此外，乙型肝炎核酸疫苗也已经进行人体试验，疟疾核酸疫苗即将在尼日利亚做大规模临床试验。 　　对基于基因疫苗的基因免疫的顾虑和安全性考虑，包括是否与细胞染色体组整合，抗DNA免疫反应的可能影响；免疫耐受；免疫效力如何进一步提高等。相信随着研究的深化，基因疫苗一定会成为预防疾病的有效新武器。 　　六、转基因植物疫苗 　　转基因植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合，生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。动物试验已证实，转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性，注射入动物体内能产生特异性抗体；用转基因植物组织饲喂动物，转基因植物表达的抗原递呈到动物的肠道相关淋巴组织，被其表面特异受体特别是M细胞所识别，产生黏膜和体液免疫应答。 目前用转基因植物生产基因工程疫苗主要有两种表达系统，一是稳定的整合表达系统，把编码病原体保护性抗原基因导入植物细胞内，并整合到植物细胞染色体上，整合了外源基因的植物细胞在一定条件下生长成新的植株，这些植株在生长过程中可表达出疫苗抗原，并把这种性状遗传给子代，形成表达疫苗的植物品系。二是瞬时表达系统，主要是利用重组植物病毒为载体将编码疫苗抗原的基因插入植物病毒基因组中，再用此重组病毒感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表达。由于每个寄主植株都要接种病毒载体，所以瞬时表达不易起始，但可获得高产量的外源蛋白质。该类疫苗可按剂量食用以达到免疫接种的目的，所以，这类疫苗又称为食用疫苗。 　　用转基因植物已成功表达大肠杆菌热不稳定毒素B亚单位(LTB)、霍乱弧菌肠毒素B亚单位(CTB)、乙型肝炎表面抗原 　　目前，用转基因植物已成功表达大肠杆菌热不稳定毒素B亚单位(LTB)、霍乱弧菌肠毒素B亚单位(CTB)、乙型肝炎表面抗原、兔出血症病毒VP60蛋白、口蹄疫病毒VP1蛋白、传染性胃肠炎病毒S蛋白、狂犬病病毒G蛋白和呼吸道合胞体病毒G蛋白、F蛋白等。此外，寄生虫的抗原如疟原虫抗原，亦在转基因植物中得到表达。动物试验表明，表达的抗原均能刺激产生特异性抗体应答，并产生一定的保护作用。 七、T细胞疫苗 　　T细胞疫苗是指将T细胞或体外T细胞表位多肽刺激产生的T细胞作为疫苗接种，用于治疗某些自身免疫疾病。但将依据MHC-I类分子特异的多肽结合基序(MHC binding motif)合成的多肽，在体外诱导产生的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)，用于治疗病毒性疾病，则是近几年的新思维、新设想。它将T细胞从过去应用为靶细胞转变成效应细胞，为T细胞疫苗的概念增添了新的内涵。T细胞疫苗是用多肽在体外诱导产生特异性CTL，后者被克隆、扩增、筛选和鉴定后，仅将MHC-I类限制的CD8+T细胞输入机体，诱导细胞免疫应答产生，从而解决了多肽疫苗存在的上述问题，而且直接回输CTL，可以人为地控制CTL的强度，避免其过度，导致大量受染肝细胞死亡，也可避免其过低，无清除病毒作用。 　　T细胞受体(TCR)疫苗是用TCR代替自身反应性T细胞进行接种，动物实验获得了较理想的免疫效应。TCR疫苗是T细胞疫苗的深化，也属于多肽疫苗。它在自身免疫性疾病治疗和抗移植排斥反应中有独到的优越性。 　　八、树突状细胞疫苗 　　树突状细胞是专职抗原递呈细胞，能有效地将抗原递呈给T淋巴细胞，从而诱导CTL活化。荷载抗原的树突状细胞具有疫苗的功能，故称树突状细胞疫苗。荷载抗原既可以是病毒抗原，也可以是肿瘤细胞，还可以是编码肿瘤抗原的基因。该类疫苗可以不依赖于CTL靶细胞，有较高的抗原递呈效率，可用于免疫治疗。